深入解析：基因测序的基本原理及应用

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1. 第一代测序（Sanger测序）

关键词：双脱氧测序、末端终止测序

1.1 正常DNA的合成过程

在模板链和引物存在的情况下，核糖体RNA分别将四种脱氧核糖酸(dNTP)转运至引物末端。然后根据互补碱基配对的原理脱水形成5"-3"磷酸二酯键。

正常的DNA合成过程

1.2 Sanger测序原理

采用链终止法，即将脱氧核糖酸（dNTP）和双脱氧核糖(ddNTP)同时加入到反应体系中。两者都可以随机整合到模板链中形成DNA，但由于缺少羟基（-OH），ddNTP的反应在整合到模板链中时随机终止。利用ddNTP的这一特性，结合电泳条带的检测或利用光源信号传输即可获得序列。

ddNTP 与引物结合后，反应无法继续。

ddNTP随机组合产生不同长度的带

每个系统都进行电泳以分别读取信号。

利用光信号转换读取

1.3 Sanger测序优缺点

优点：方法简单，准确度高，测序片段长，一次可达1kb。缺点：高成本、低通量

2. 第二代测序（Illumina测序为例）

关键词：桥式PCR，可逆末端终止，高通量，边合成边测序Illumina 的Solexa和Hiseq两个系列机器是目前全球使用最多的第二代测序机。为了获得完整的基因组，通常包括三个阶段：测序、短序列比对和序列拼接。IIIumina测序数据三大阶段的特点：读长短、一定的错误率、深度高、reads之间有pairend关系

2.1 测序

测序过程大致分为三个步骤。测序完成后，获得的原始数据将经过质量评估和控制等中间过程，然后进入短序列拼接。

测序三大步骤中制备DNA基因组样品时，单倍体选择、样品总量、DNA浓度OD需要满足要求，并注意不要降解。

2.1.1 第一步：构建基因文库

步骤一：使用超声波将待测DNA样本破碎成小片段，通常约为500bp。

步骤二：将小片段修复成钝端，并在钝端进一步添加A碱基，形成粘端。

步骤三：在粘性末端添加接头适配器、测序引物、标签等。

图书馆建设流程

最终的文库形式文库：是DNA 片段的集合。测序片段断裂后，形成文库。一般将片段小于1kb的文库称为小片段文库(pairend)，大于1kb的文库称为大片段文库(matepair)。文库的大小也称为插入片段大小，可用于后续的拼接。

2.1.2 第二步：桥式PCR

步骤一：液体流过流动池后，单个DNA 序列将被固定到流动池上。

步骤二：执行多重桥式PCR 扩增。

步骤三：多余的DNA 序列将被液体冲走，在流动池上留下相同的DNA 单链簇。

流通池

桥接PCR的一般流程。桥式PCR的目的是增加信号源，方便检测。其详细原理可参考：

修拉_

2.1.3 第三步：测序

步骤一：将DNA 聚合酶、接头引物和4 种带有碱基特异性荧光标记的dNTP 添加到反应体系中。

步骤二：合成第一个碱基后，后续反应无法正常进行。

步骤三：除去剩余的未使用的碱和试剂。

步骤四：激发基础荧光并收集信号。

步骤五：去除第一个碱基的封闭基团和荧光基团。

步骤六：重复步骤一到五。

每个序列需要测序两次。正向引物测序后会被液体洗掉，然后用反向引物对另一端进行测序。

合成测序

双端测序

读取信号类似于同一张照片的叠加

2.1.4 测序饱和度评估

目的：推测测序所需的最小数据量理论上是数据量的10倍，但实际上还有其他误差，所以会高于该值。

理论最小值

2.1.5 数据质控

1. 两个指标碱基含量分布：测序后的GC含量应与基因组GC含量相同。碱基质量分布：Q20碱基百分比（一般要求90%以上）、Q30碱基百分比（一般要求85%以上） Q20表示该位点碱基的错误率为百分之一，Q30为千分之一。

2. 用fastqc可生成质量控制报告

质量报告对比

2.1.6 测数数据处理——过滤

非基因组序列。包括接头、测序引物、标签等。N碱基过多的reads。通常，如果N 碱基占读数的10% 以上，则会被去除。低质量reads。以Q20为标准，低于一定水平的Q20比例将被剔除。去除duplication。两对相同的读数将消除一对。注：只要pairedend reads中的一个reads不满足条件，就需要移除这两个reads。 RNA-seq和16s测序时不能去除重复，否则会丢失一些丰度信息。

2.2 测序拓展内容

2.2.1 大片段文库

事实上，无论是大片段库还是小片段库，都无法完全测量一次read的全长。例如，Illumina构建的小片段文库为500bp。双端测序一般只能测两端150bp左右的长度，中间200bp无法测。但由于最初建库时的随机中断，第一次read无法测序中间序列，后续reads也会检测到中间序列。

1.png1. 构建大片段文库的目的：为了获得reads之间的物理距离关系，以方便后续的序列拼接。

2. 大片段文库的测序过程：步骤1：在大片段的两端添加生物标志物序列进行环化。

步骤2：后续步骤与小片段文库测序类似

环化处理

将大片段打碎成小片段进行测序

3. pairend和matepair文库区别测序reads方向不一致，pairend方向相反，matepair方向相反。

反向配对

matepairverse

2.2.2 测序注意事项

无法一次性对整个基因组进行测序，因为PCR技术限制了读长，并且很难保证从样本中提取的基因组的完整性。

GC偏差会影响PCR，正常GC含量为35%~65%。

所选文库的大小和读长必须协调； Denove拼接过程中，先使用小片段文库，逐渐增加文库；

二代测序无法持续测量，因为随着反应的进行，后续反应条件发生变化；同时，在簇化过程中，由于碱基反应的相位不一致，会出现错误。

2.3 短序列比对

短序列比对是将过滤后的reads重新定位到基因组中。这个过程也称为映射。

2.3.1 短序列比对的四种情况

一对一、无错配一对一、有错配一对多、无错配多对多、有错配

2.3.2 短序列比对的应用

1. 与自身基因组比对1.1 计算每个站点的覆盖深度

1.2 计算参考序列覆盖率

2. 与参考基因组比对2.1 RNA测序计算基因表达

2.2 变异检测

2.3 宏基因组测序计算不同生物的丰度

2.3.3 基因差异表达计算

1. 基因结构基因结构2. 成熟mRNA成熟mRNA

3. 基因表达差异的指标3.1 FoldChange，同一基因在不同样本中表达水平的变化倍数，即RPKM值的差异。差异越大，变化就越大。

3.2 FDR校正，FDR越小，差异越显着。注：转录起始位点位于启动子区和5"UTR非翻译区之间，翻译起始位点位于CDS起始密码子处。 RPKM值消除了基因长度和测序量的差异对计算基因表达量的影响，可以直接用于比较不同样本之间基因表达量的差异（可变剪接的FPKM值）。

2.3.4 变异检测

单碱基转换：转换、颠换、删除、插入

2.3.5 物种组成和丰度计算

步骤一：16s序列长度约为1.5kb，无法一次性测试。使用双端测序和质控过滤得到不同的reads，但不能去除重复。

步骤二：将两个读取拼接到标签中

步骤三：将不同标签集群到不同的OUT

步骤四：与16s数据库比较并设置阈值。

2.4 序列拼接

又称为de nove splicing，将测序得到的reads输入到拼接软件中，利用reads之间的重叠部分进行拼接。

目前序列拼接的算法有两种：一种是Overlap-Layout-Conesensus（常用于拼接长片段如Sanger），另一种是De bruijn graph（常用于拼接短序列如Illumina）。但本质是根据序列之间的重叠进行剪接。

常见名词：reads，直接从测序获得的片段pairend和matepair，文库大小insertsize，物理长度kmer，将读段切割成更小的固定片段contig，通过kmers 之间的重叠连接成更长的片段（有时也指将读段串联成重叠群） )scaffold，重叠群通过pairend关系连接成更长的片段。

2.4.1 kmer值估计基因组大小

1. kmer定义kmer 两次读取kmer，一次是正向，另一次是反向补码。

2. 利用kmer的分布图估计基因组大小kmer分布图

2.4.2 基于德布莱英图(De bruijn graph)算法拼接

1. 构图（gregraph）是切掉kmer（13-127之间的奇数），去掉频率为1的kmer（kmer频率为1，那么对应的reads只测一次，这在高通量测序中几乎是不可能的）

2. 构建contig利用不同kmer大小的片段之间的重叠形成Debraying图，然后简化该图。理论上，该图只有一个头和一个尾，但由于测序过程中存在重复区域。实际的脑解图会有很多头和尾。然后将较短的分支去除，形成很多contig，并且contig之间没有重叠关系。

De bruijn graph3. 构建scaffold构建过程通过reads之间的配对关系，contigs连接成更长的序列，这就是scaffold。首先，将测序的读数重新定位到重叠群，然后记录配对比较。落在同一contig用于计算insertsize，落在不同contig用于构建scaffold。（例如：reads1对齐到contig1的末尾150bp，reads2对齐到contig2的开头150bp。reads1和reads2之间的insetsize为500，那么在连接contig1和contig2的过程中就会有200bp的N个碱基(存在) 比较过程中要注意reads的方向。

作图通常需要三对以上的不同重叠群来确定物理位置关系，并进一步将它们连接成支架。

image.png 当基因组中重复序列过多时，pairend关系可能不足以确定contig之间的位置关系。在这种情况下，需要使用matepair库。拼接策略：先使用小片段库，然后逐步添加大片段库。然而，获得完整的基因组序列通常很困难。特点支架序列方向不一致，有的来自有义链，有的来自反义链（但都是5"-3"）。

脚手架之间没有位置关系，但有些软件会按大小顺序输出。

scaffold中可能存在N碱基，但contig序列中没有N碱基。4. 补洞基因组中的孔（称为间隙）由N 个碱基组成。间隙是在重叠群形成支架的过程中产生的。

有关gap：N个碱基数是由insertsize决定的，但并不完全准确。 N碱基来自基因组的复杂区域（重复、GC异常等）并且不容易剪接。补洞策略

使用桑格测序长片段补洞

如果N区太大（超过2k），可以用pacbio测序来补长片的空洞。

利用pairend关系补洞

3. 第三代测序

主要包括三种测序技术，分别利用光信号、电信号和化学信号的转换

3.1 PacBio公司的SMAT

1. 原理概述应用边合成边测序的思路，利用SMRT芯片作为测序载体，将DNA聚合酶与模板结合，用4色荧光标记4个碱基。在碱基配对阶段，不同碱基的加入会发出不同的光，根据光的波长和峰值可以确定传入碱基的类型。保持酶活性，区别反应信号与周围游离碱基荧光背景是关键技术。2. 特点读长长，测序速度快，测序错误率高，可达15%。然而，错误是随机的，可以通过多次测序来有效纠正。