PD通路调控的肿瘤免疫治疗策略研究

大家好，今天来为大家分享PD通路调控的肿瘤免疫治疗策略研究的一些知识点，和的问题解析，大家要是都明白，那么可以忽略，如果不太清楚的话可以看看本篇文章，相信很大概率可以解决您的问题，接下来我们就一起来看看吧！

影响因子：8.110

DOI: 10.1080/2162402X.2021.1947569

一、背景

2018年，全球报告了超过80万例头颈肿瘤新病例。每年有超过40万患者死于该疾病，其中约90%为头颈鳞状细胞癌（HNSCC）亚型。大约19-46% 的HNSCC 患者被诊断为淋巴结转移，15-50% 的患者在接受标准护理治疗后出现肿瘤复发。

越来越多的证据表明人类癌症（包括晚期头颈部鳞癌）的肿瘤微环境存在免疫失调。 PD-1，又称CD279，是一种重要的免疫抑制检查点分子，主要表达于活化的B细胞、NK细胞、T细胞和APC上。通过靶向PD-1/PD-L1 轴来阻断免疫检查点可以提高复发/转移性(R/M) HNSCC 患者的生存率。 PD-L2 是PD-1 的另一种配体。它在某些功能上与PD-L1相似，主要影响调节性T细胞。

二、材料与方法

1.数据来源

1) 59 例接受手术的HNSCC 患者

2) HNSCC标本：包括61例原发性HNSCC组织、8例转移性HNSCC组织和11例正常舌组织

2.实验流程

1) 免疫组织化学中样品的去糖基化

2）生存树分析模型：利用最小深度和变量重要性（VIMP）建立生存树分析（STA）模型；采用Kaplan-Meier分析方法评估节点

3）体内异种移植肿瘤模型：小鼠实验

4) 循环肿瘤细胞的分离、TILs的分离和分析

5）单细胞测序：GSE163872

6）Pathway分析和基因组富集分析：使用基因组富集分析（GSEA）来分析scRNA-seq数据

7)统计分析：采用Mann-Whitney U检验或Wilcoxon配对t检验、McNemar或卡方检验、ANOVA检验进行分析；采用多变量Cox回归模型和Kaplan-Meier分析评估生存率

三、实验结果

01、PD-L2在大多数HNSCC患者中都有表达

该研究总共纳入了59 名HNSCC 患者。患者以男性（69.49%）和吸烟者（61.02%）为主，其中口腔原发肿瘤28例。记录了48 例(81.4%) 死亡，中位随访时间为45 个月。所有肿瘤标本用于PD-L2和PD-L1表达分析的患者在诊断时均接受了手术，并且未接受任何新辅助治疗，包括化疗或放疗。

IHC染色显示PD-L2在大多数肿瘤中表达（图1a）。此外，PD-L2水平与AJCC分期密切相关（图1b）。与非转移性肿瘤相比，淋巴结转移性肿瘤样本中的瘤内PD-L2+ 细胞密度显着更高（图1c）。 59 份标本中有15 份检测到PD-L1 表达。 PD-L1阳性肿瘤细胞的染色密度和强度明显弱于PD-L2阳性肿瘤细胞。 PD-L1和PD-L2在肿瘤中的表达密切相关。此外，在PD-L1阴性样本中，61.36%的肿瘤样本为PD-L2阳性（图1d）。同时表达PD-L2 和PD-L1 的样本以及仅表达PD-L2 的样本比仅表达PD-L1 的样本更常见。这些结果表明，HNSCC 样本的瘤内PD-L2 水平高于PD-L1，表明PD-L2 在PD-L1 缺失的情况下在免疫抑制中发挥代偿作用。

43 例HNSCC 标本的基质中PD-L2 呈阳性。肿瘤中PD-L2阳性细胞的密度高于间质，但差异无统计学意义（图1e）。此外，基质中PD-L1的表达没有统计学意义。肿瘤PD-L1表达与基质中PD-L2表达强度之间没有相关性。

作者进一步验证了HNSCC标本中PD-L2的表达（图1f），其中包括61个原发性HNSCC组织、8个转移性HNSCC组织和11个正常舌组织。 86.96%的肿瘤标本呈PD-L2阳性，且与原发肿瘤和非肿瘤组织相比，转移性肿瘤显示出更高的PD-L2水平（图1g）。

图1 HNSCC标本中PD-L2的表达和分布

02、HNSCC标本的PD-L2表达和临床病理学特征

PD-L2的表达与淋巴结转移、AJCC分期和分化分级呈正相关。在单变量分析中，原发部位、淋巴结转移、分化分级和临床分期(AJCC 2018)、瘤内PD-L2、CD3、CD8 和间质CD3 与不良预后相关。淋巴结转移患者中62.5% 的肿瘤显示中度或高度PD-L2 染色。 PD-L2和CD8状态是肿瘤的独立预后因素。

03、PD-1的表达与PD-L2的表达有关

PD-L2 通过与PD-1 阳性TIL 结合，在HNSCC 的免疫逃避中发挥重要作用。 38.98%的肿瘤标本为PD-1阳性TIL。 PD-1阳性细胞表现出较高的CD8表达水平，并且PD-1+TIL与CD8+TIL呈正相关（图2a）。值得注意的是，PD-1+TIL 的中位数与PD-L2 表达强度呈正相关（图2b）。

观察到四种不同的肿瘤微环境：I型，适应性免疫抵抗，在32%的病例中观察到TIL和PD-L1表达； II 型，免疫忽视，22%，同时缺乏TIL 和PD-L1 III 型，内在诱导，在39% 的PD-L1 和PD-L2 表达以及TIL 缺陷病例中观察到； IV型，耐药，7%存在TIL缺陷病例中观察到PD-L1表达（图2c）。此外，经常观察到PD-L2和PD-1的存在以及PD-L1的缺失（图2d）。

图2 HNSCC

04、PD-L2在小鼠异种移植肿瘤模型的免疫抑制中起关键作用

中PD-1、PD-L1和PD-L2表达的异质性作者建立了C3H免疫活性小鼠模型，并研究了PD-L1功能存在下PD-L2的潜力（图3a）。 PD-1或PD-L2的单克隆抗体（mAb）显示出显着的抗肿瘤作用，而PD-L1 mAb对肿瘤生长的抑制作用有限（图3b、c）。 PD-L2 mAb 组TIL 中活化的CD8+IFN-+ T 细胞数量是PD-L1 mAb 组的两倍（图3d）。在CD335+NK 和NK1.1+NKT 细胞数量中发现了类似的模式（图3e、f）。与PD-L1 mAb 组相比，PD-L2 mAb 组的细胞毒性T 细胞活性有所增加，如颗粒酶B 免疫染色所示（图3g）。这些结果表明，用PD-1或PD-L2的单克隆抗体治疗可以极大地诱导免疫细胞浸润到肿瘤中。此外，代表肿瘤高转移能力的CTC 在PD-1 mAb 和PD-L2 mAb 组中均显着减少（图3h）。

图3 PD-L2在体内免疫抑制中发挥决定性作用。通过上述PD-L2在HNSCC中的抗肿瘤免疫作用的论证，作者进一步研究了免疫相关基因的表达与PD-L2的相关性。（图4a）。在瘤体中，CD8+ T细胞、CD3+ T细胞和FOXP3+ Tregs的密度显着低于基质中的密度（图4b）。在瘤内和间质区域，CD8+或CD3+T细胞的数量显着高于FOXP3+Treg的数量（图4b）。瘤体中FOXP3+Tregs、CD3+T细胞和CD8+T细胞的数量呈正相关（图4c）。在瘤体中，PD-L2+肿瘤细胞的密度与CD3+T细胞、CD8+T细胞和FOXP3+Tregs的密度呈正相关（图4d）。然而，基质PD-L2 与CD3、CD8 和FOXP3 之间没有显着关联。因此，PD-L2与肿瘤细胞中免疫相关基因的表达密切相关。

图4 HNSCC

05、预测HNSCC的OS的预测模型

中的免疫标记物表达作者证实，肿瘤内高PD-L2 表达与较短的OS 相关（图5a）。根据与OS 没有直接关系的CD3（图4e）、CD8（图4e）和FOXP3（图4e）的表达将样本分为两组。作者假设，由于肿瘤和基质表达，免疫细胞可能对OS 有不同的影响。数据显示CD3、PD-1和CD8的表达至少部分参与OS（图5a）。评估具有不同生物标志物表达的T 细胞亚群可能是预测HNSCC OS 的更准确的预后标志物。为了选择与生存相关的变量，本研究的STA模型中包括瘤内PD-L2和瘤内/间质CD3、PD-1、FOXP3和CD8的表达。

作者发现肿瘤内CD3、CD8 和PD-1 水平对OS 有显着影响。 PD-L2 是重要性分析中最有影响力的变量。尽管间质PD-1、间质CD8以及瘤内和间质FOXP3水平的VIMP评分分别为-0.0013、-0.0022、0.0011和-0.0026，但它们的最大值均高于最小深度截止值（0.9308）；因此，它们被排除在STA 模型之外（图5b）。

这项研究确定了可以表征HNSCC 或当前队列预后的六个节点。肿瘤内PD-L2 低且基质CD3 高的患者的预后特征与最佳中位OS 72 个月相关，而最差的生存发生在节点4，中位OS 为10 个月（瘤内PD -L2 高、瘤内CD3 低）瘤内CD8 低）（图5c）。值得注意的是，与肿瘤内PD-L2高、肿瘤内CD3低和肿瘤内CD8低特征的患者相比，肿瘤内PD-L2低和基质CD3高特征的患者具有根据预后指数预测的更长的OS（图5d）。

图5 基于PD-L2 的免疫特征与HNSCC 患者的生存相关

06、PD-L2与细胞因子IL-6有关

为了研究PD-L2 与其他因素之间的关联，作者使用scRNA-seq 分析了两名HNSCC 患者的PD-L2 表达。（图6a）。根据细胞的全局表达模式将细胞分为初步的簇，并通过特定的标记基因将簇注释为癌细胞、肌细胞、癌症相关成纤维细胞、正常成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。为了更好地分析癌细胞的异质性，作者进一步鉴定了癌细胞簇的亚簇。将癌细胞进一步分为6个簇，发现PD-L2高表达的细胞富集在簇2中（图6b）。

为了进一步了解PD-L2表达在临床环境中的作用，首先使用似然比检验来鉴定PD-L2富集簇2中与其他簇相比的差异表达基因（DEG），鉴定出819个上调的DEG，发现这819 个DEG 包含多个与不良预后相关的基因。根据GSEA 分析，与高PD-L2 表达相关的特征在“HALLMARK_HYPOXIA”、“HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE”和“HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB”组中丰富。为了证实这一结果，进行了GSVA 分析来估计和比较每个簇的癌症特征相关状态。与其他簇相比，簇2 显示属于“HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION”、“HALLMARK_HYPOXIA”和“HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE”组的基因表达量较高（图6c）。特别是，与Th2细胞因子反应相关的IL-6被确定为重叠基因，表明它与PD-L2的高表达有关（图6d）。

为了进一步验证PD-L2 和IL-6 之间的潜在相互作用，作者对59 份人类HNSCC 样本进行了IHC。共有59.32%的HNSCC标本呈IL-6阳性，其中弱染色27.12%，中度染色20.34%，强染色11.86%（图6e）。 IL-6 高表达的患者OS 较差（图6f），且IL-6 水平与PD-L2 水平呈正相关（图6g）。